王群光醫師的中道自然醫學

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【氫分子生物學】氣相色譜法

【氫分子生物學】氣相色譜法

氫分子生物學研究首先是生物學研究,和其他生物學研究的手段沒有區別,氫分子生物學本身區別於其他研究的關鍵內容是氫氣濃度的檢測,因為氫氣的濃度檢測對分析氫氣在體內運行規律,氫氣在身體內的分布特點以及氫氣的劑量-效應關係等都是十分必要的研究內容。用於檢測氫氣的手段有許多,其中最經典的是氣相色譜檢測技術,最方便的是氫氣電極檢測技術,而最簡單的是氧化滴定技術。

氣相色譜技術可以定量分析微量甚至痕量的氫氣。氫氣電極檢測技術可以測量的範圍非常大,即可以檢測微量的氫氣,例如組織中的氫氣,也可以檢測溶液中濃度比較高的氫氣,更重要的是這種方法可以進行連續在體檢測,對研究氫氣的劑量-效應具有其他方法無法取代的地位。氧化滴定技術本身的敏感性和選擇性都比較差,而且受到檢測樣本的氧氣或各類氧化還原性物質的影響,更多地用於氫氣水產品的定性鑒定。另外,採用質譜法可以檢測極低濃度的氫氣,一般情況下氫分子生物學效應研究中很少採用。

本章對這些技術進行簡單介紹,關於具體的操作需要根據具體試驗要求,結合特殊的儀器操作程序進行檢測。

 

第一節  氣相色譜法


氣相色譜法測定氫氣的濃度在氫分子生物學研究中廣泛採用,可以對氫氣溶液中氫氣或血液中氫氣的濃度進行檢測, 例如2007年的第一篇氫分子生物學論文都曾經採用這種方法,最近有學者用這種方法檢測了人呼吸氫氣後血液中氫氣的濃度變化規律(圖8-1)。

氣相色譜法是用氣體作為移動相的色譜法。常用來分析高純氣體中的雜質及工業生產中的低濃度氣體。根據所用固定相的不同可分為兩類:固定相是固體的,稱為氣固色譜法;固定相是液體的則稱為氣液色譜法。按色分離原理來分,氣相色譜法亦可分為吸附色譜和分配色譜兩類,在氣固色譜中,固定相為吸附劑,氣固色譜屬於吸附色譜,氣液色譜屬於分配色譜。



圖8-1 人呼吸1%~4%氫氣前後血液氫氣濃度(umol/L)的變化
(圖片來自Ono et al. Med Gas Res. 2012,2:22)



按色譜操作形式來分,氣相色譜屬於柱色譜,根據所使用的色譜柱粗細不同,可分為一般填充柱和毛細管柱兩類。一般填充註是將固定相裝在一根玻璃或金屬的管中,管內徑為2~6 mm。毛細管柱則又可分為空心毛細管柱和填充毛細管柱兩種。空心毛細管柱是將固定液直接塗在內徑只有0.1~0.5 mm的玻璃或金屬毛細管的內壁上,填充毛細管柱是近幾年才發展起來的,它是將某些多孔性固體顆粒裝入厚壁玻管中,然後加熱拉制成毛細管,一般內徑為0.25~0.5 mm。在實際工作中,氣相色譜法是以氣液色潛為主。

氣相色譜技術所用的儀器為氣相色譜儀。除另有規定外,載氣為氮氣。色譜柱為填充柱或毛細管柱,填充柱的材質為不銹鋼或玻璃,載體用直徑為0.25~0.18、0.18~0.15或0.15~0.125 mm經酸洗並硅烷化處理的硅藻土或高分子多孔小球。常用玻璃或彈性石英毛細管柱的內徑為0.20或0.32 mm。這樣口溫度應高於柱溫30~50℃,這樣量一般不超過數微升,柱徑越細進樣量應減少。

氣相色譜系統由盛在管柱內的吸附劑或惰性固體上塗著液體的固定相和不氣相色譜法斷通過管柱的氣體的流動相組成。將欲分離、分析的樣品從管柱一端加入後,由於固定相對樣品中各組分吸附或溶解能力不同,即各組分在固定相和流動相之間的分配系數有差別,當組分在兩相中反覆多次進行分配並隨移動相向前移動時,各組分沿管柱運動的速度就不同,分配系數小的組分被固定相滯留的時間短,能較快地從色譜柱末端流出。以各組分類柱末端流出的濃度c對進樣後的時間t作圖,得到的圖稱為色譜圖。從色譜圖可分析各組分在進樣後至其最大濃度流出色譜柱時所需的保留時間,與組分通過色譜柱空間的時間,及組分在柱中被滯留的調整保留時間的關係。

從柱後流出的色譜峰不是矩形,而是一條近似高斯分布的曲線,這是由於組分在色譜柱中移動時,存在著渦流擴散、縱向擴散和傳質阻力等因素,因而造成區域擴張。在色譜柱內固定相有兩種存放方式,一種是柱內盛放顆粒狀吸附劑,或盛放塗敷有固定液的惰性固體顆粒;另一種是把固定液塗敷或化學交聯於毛細管柱的內壁。用前一種方法制備的色譜柱稱為填充色譜柱,另一種方法制備的色譜柱稱為毛細管色譜柱。

經過分離的樣品中目標組分檢測到色譜峰信號進行積分,根據和標準品進行比對和計算出相應成分的濃度。氫分子生物學除呼吸氫氣濃度檢測外,一般都是對溶液或生物樣品中的氫氣濃度進行檢測。氣相色譜技術在本質上是屬於組分分離技術,對氫氣的檢測,可以採用頂空瓶加熱釋放的方法將氫氣從溶液中釋放出來進行檢測。而不同的檢測方法,對氫氣的濃度分辨率存在巨大的差別。例如採用普通的熱導檢測技術,只能檢測到數個10-6量級的體積分數,這顯然無法檢測只有1.0×10-8以上生物樣品中的氫氣體積分數。檢測生物樣品中氫氣的積體分數,例如血液中氫氣的體積分數,一般都是10×10-9以上體積分數,其檢測難度則比較大。

Takao等將氣相色譜分離技術與原子吸收光譜的高靈敏度性能結合起來,制作了氫氣分析儀。他們將氖氣作為載氣,經過淨化器除去雜質氣體後與樣品氣體在控制閥箱內形成混合氣體,然後進入分離柱,分離柱處在充滿液氮(溫度為-196℃)的密閉容器中,樣品氣體中含有的一氧化碳、氧氣等氣體由於沸點高於-196℃而被從混合氣體中分離出來,經除雜後的氫氣被送入原子吸收痕量還原檢測器(TRD),在此氫氣還原氧化汞發生化學反應,產生水和汞蒸氣。通過原子吸收方法檢測汞蒸氣就可以得到相應的氫氣含量。應用該方法可檢測到的氫氣最低體積分數為5×10-9。該方法是一種非常靈敏的氫氣檢測技術,巧妙地應用氧化汞與氫的化學反應,對產生的汞蒸氣進行原子吸收光譜法檢測。但是該方法分離雜質所要求的極低溫度卻不易獲得,目前只限於實驗室研究,難以滿足普通現場氫氣檢測的要求。

以上文章出自http://www.ckwang.com.tw/n-H2-801.html



 

 
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